PCR，又稱聚合酶鏈式反應，基本原理類似于 DNA 的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR 由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成。本文詳細整理了 PCR 實驗原理、實驗步驟、引物設計、結果分析，以及各種 PCR (RT-PCR、Realtime-PCR、QPCR)的區(qū)別、實驗方法和常見問題匯總。
 
一、實驗目的
1.掌握聚合酶鏈式反應的原理。
2. 掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術。
 
二、實驗原理
PCR技術，即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學獎）建立的。這項技術可在試管內的經(jīng)數(shù)小時反應就將特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。它不僅是DNA分析最常用的技術，而且在DNA重組與表達、基因結構分析和功能檢測中具有重要的應用價值。
PCR可以被認為是與發(fā)生在細胞內的DNA復制過程相似的技術，其結果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；
②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。
重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
 
三、實驗試劑與器材
模板DNA、2.5mmol/L dNTP
Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物
10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O
PCR儀、移液槍、PCR板
 
四、實驗步驟
1、配制20μL反應體系，在PCR板中依次加入下列溶液：
模板DNA    2μL
引物1      1μL
引物2      1μL
dNTP      1.5μL
MgCl2        2μL
10×buffer    2μL
ddH2O      10μL
Taq酶      0.5μL
 
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